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    公开号:WO1984001778A1
    申请号:PCT/EP1983/000280
    申请日:1983-10-27
    公开日:1984-05-10
    发明作者:Hubert Koester
    申请人:Hubert Koester；
    IPC主号:C07H21-00
    专利说明:
    [0001] Beschreibung Verfahren zur Herstellung von Oligonucleosidphosphonaten.
    [0002] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligonucleosidphosphonaten. Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen, zu denen auch die entsprechenden Oligodeoxynucleosidphosphonate gehören, können als lipophile Hypridisierungsanaloga eingesetzt werden, d.h. sie können in hydrophile Oligonucleotide eingebaut werden, damit diese die Zellmembran leichter passieren können und in der Zelle mit basenkomplementären Nucleinsäureseguenzen interagieren (hybridisieren).
    [0003] Nucleinsäureanaloge mit Modifikationen entweder an dem Zuckerteil oder an den Internucleotidbindungen sind bekannt, z.B. in Form von Nucleosidphosphiten, Nucleosidphosphonaten und Nucleosidthiophosphonaten.Auch Deoxynucleosid-methylphosphonatdiester sind bereits hergestellt und untersucht worden. Die Phenyl-und Methylphosphonodiester von Deoxynucleosiden sind unter Verwendung einer modifizierten Triestermethode in homogener Phase erhalten worden, allerdings bei längeren Kondensationszeiten; für die Herstellung der Produkte in reiner Form sind umfangreiche Reinigungsmaßnahmen erforderlich gewesen.
    [0004] Es sind Oligonucleotidsynthesen bekannt, die rasch durchgeführt werden können und hinreichend gute Ausbeuten liefern, bei denen ein Teil der Reaktanten chemisch an einen polymeren Träger, z.B. Glas mit kontrollierten Porendurchmessern, gebunden sind. Das Verfahren der Erfindung verwendet ebenfalls polymer gebundene Reaktanten; es kann in extrem kurzer Zeit durchgeführt werden und liefert hohe Ausbeuten der gewünschten Nucleosidphosphonate.
    [0005] Die erfindungsgemäß hergestellten Oligonucleotidphosphonate weisen die folgende allgemeine Formel I auf:
    [0006]
    [0007] In der Formel I bedeutet B eine Nucleobase, z.B. A, C, G oder T oder deren Analoga.
    [0008] R1 bedeutet eine gegebenenfalls verzweigte Alkylgruppe mit 1-10 Kohlenstoffatomen, die mit bis zu 4 Chloratomen oder einer Cyangruppe substituiert sein kann. Hierzu gehören u.a. Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, sec.-Butyl, tert.-Butyl, 2,2,2-Trichlorethyl oder Cyanethyl. Die Gruppe R1 kann weiterhin eine gegebenenfalls mit niedrigem Alkyl, niedrigem Alkoxy, Cyan, Halogen, insbesondere Chlor oder Brom, oder Nitro substituierte Aryl oder Aralkylgruppe sein, insbesondere Phenyl- oder Benzylgruppen.
    [0009] Die Gruppe R2 kann Wasserstoff sein; es handelt sich dann bei den
    [0010] Verbindungen der Erfindung um Oligodesoxynucleosidphosphonate. Die Gruppe R2 kann auch Hydroxyl oder gegebenenfalls mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschütztes Hydroxyl sein. Derartige Schutzgruppen sind z.B. Trityl,Monomethoxytrityl und Dimethoxytrityl; Acyl, z.B. Acetyl oder Benzoyl; Tetrahydropyranyl, Methoxytetrahydropyranyl, o-Nitrobenzyl sowie Silylether wie z.B. t-Butyldiphenylsilylether.
    [0011] n bedeutet in der allgemeinen Formel I eine ganze Zahl von 2 - 50.
    [0012] Das Verfahren der Erfindung ist durch die folgenden Reaktionsschritte gezeichnet:
    [0013] a) Umsetzung eines Nucleosids der allgemeinen Formel II
    [0014]
    [0015] in der
    [0016] A eine in der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppe, die sich z.B. aus Tetrahedron 1981, Seite 363 - 369, Liebig's Ann. Chem. 1978, 839 - 850, sowie Nucleic Acids Research, Symposium Series No. 7, 1980, 39 - 59 ergibt.
    [0017] B' die gegebenenfalls mit in der Nucleotidchemie üblichen und ebenfalls in der oben genannten Literatur beschriebenen Schutzgruppen geschützte Nucleobase B und R1 wie oben definiert ist.
    [0018] mit einem Halogenphosphin der allgemeinen Formel III
    [0019]
    [0020] in der X Chlor oder Brom
    [0021] Z Chlor oder Brom,
    wobei R1 wie oben definiert ist, oder ein reaktiver heterocyclischer Rest ist (der reaktive heterocyclische Rest kann Triazolyl, Tetrazolyl, 3-Nitro- 1,2,4-triazolyl oder dergleichen sein und ist über ein N-Atom mit dem P-Atom verbunden),
    [0022] und R1 wie oben definiert ist,
    [0023] in Gegenwart einer organischen Base, z.B. Pyridin, Lutidin oder Collidin,
    [0024] b) Umsetzung des in Schritt a erhaltenen Nucleosid-phosphonoderivates der allgemeinen Formel IV
    [0025]
    in der A, B' , R1 , R2 und Z wie oben definiert sind,
    [0026] mit einem an einen polymeren Träger gebundenen Nucleosid der allgemeinen Formel V
    [0027]
    [0028] in der B' und R2 wie oben definiert und T der polymere
    [0029] Träger ist, wobei als lösliche oder unlösliche (vernetzte) polymere Träger,z.B. modifiziertes Silicagel, Polyester, Polyamid, Polyvinylalkohol, Polysiloxan, Polystyrol, Glas oder dergleichen vorgesehen ist; als Verankerungsfunktion zwischen Träger und Nucleosid kommen vorzugsweise Esterbindungen in Betracht, auch solche, die sich vom Lävolinyl- oder ß-Benzoylpropionylrest ableiten; die letztgenannten Esterbindungen können unter neutralen Bedingungen mit N2 H4 gespalten werden,
    [0030] c) Oxydation des in Stufe b erhaltenen Träger gebundenen Nucleotidonucleosids der allgemeinen Formel VI
    [0031]
    in der R, B' , R1, R2 und T wie oben definiert sind, wobei die Oxydation zum Phosphonat z.B. mit Jod erfolgen kann, allgemein unter Oxydation hier jedoch die Einführung von O, S oder Se zu verstehen ist,
    [0032] d) Maskierung freier 5' OH-Gruppen die bei der Reaktion gemäß Stufe b nicht umgesetzt wurden, mit einer permanenten Schutzgruppe, z.B. durch Reaktion mit Acetanhydrid oder
    [0033] e) Abspaltung der Schutzgruppe A, z.B. durch Verwendung einer Protonsäure oder einer Lewis-Säure wie ZnBr2 oder Dialkylaluminiumchlorid, wenn A eine Tritylgruppe oder ein Methoxyderivat derselben ist,
    [0034] f) gegebenenfalls Einführung weiterer Nucleosidphosphonat-oder Oligonucleosidphosphonateinheiten entsprechend den Reaktionsschritten a - e sowie
    [0035] g) Spaltung der Nucleosid-Trägerbindung mit Basen, z.B. Ammoniak, oder Hydrazin bei pH=7, und gegebenenfalls Abspalttang aller in den Oliqonucleosidphosohonaten, insbesondere den Nucleobasen, noch vorhandenen Schutzgruppen.
    [0036] Die Zwischenprodukte der allgemeinen Formel IV stellen neue Verbindungen dar. Sie unterscheiden sich von den reaktionsträgen Phosphonigsäuremonoestern Z=O-durch eine um ein Vielfaches gesteigerte Reaktionsgeschwindigkeit bei dennoch gegebener Selektivität. Dadurch wird es möglich, die Verbindungen I in überraschend kurzer Zeit und mit unerwartet hohen Ausbeuten herzustellen, wenn man einen polymergebundenen Reaktanten gemäß der Formel V verwendet.
    [0037] Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels zur Herstellung der Deoxynucleosid-methylphosphondiester d(AC) , d(AT), d(ATG) und d(ATTT) näher erläutert. Weitere Einzelheiten der Reaktion und physikalische Kenndaten der hergestellten Oligonucleosidphosphonate ergeben sich aus dem folgenden Reaktionsschema und der Tabelle.

    [0038] Ausführungsbeispiel
    [0039] Das N-geschützte Nucleosid, gebunden an ein Glas mit gleichförmigen Porendurchmessern (CPG) wird wie in der Literatur beschrieben hergestellt, vgl. Tetrahedron Letters 1981 , 4177.
    [0040] Ein mMol N-Acyl-5'-O-trityldeoxynucleosid, gelöst in 1 ml trockenem THF, wird zu einem Gemisch von 5 mMol 2,6-Lutidin und 1 mMol Methylchlorphosphin) in 1 ml THF bei -78°C unter einer Schutzgasatmosphäre gegeben; die Zugabezeit beträgt 15 - 20 Minuten. Nach 30 Minuten läßt man das Gemisch langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Das Lutidin-Hydrochlorid wird abfiltriert; das Filtrat wird unter verringertem Druck eingeengt. Man dampft zweimal mit Toluol/THF (10 ml, 1:1) bis zur Schaumbildung ein und löst das Gemisch in 5 ml THF, das 5 mMol 2,6-Lutidin enthält; man erhält eine 0,2 M-Lösung. Die aktive Nucleosid-methylphosphonomonochloriditlösung (1 ml) wird mit einer Spritze in eine mit einem Septum verschlossene Säule gegeben, die das an CPG-Perlen(100 -200 mg) gebundene Nucleosid (10 - 20 μMol) enthält. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten wird das Reagenz durch Schutzgasdruck entfernt. Das System wird evakuiert und erneut mit 1 ml des aktiven Nucleosids 10 Minuten beschickt. Die Kondensationsausbeute wurde durch Bestimmung der Tritylkationenkonzentration bestimmt. Nach einer mehr als 95%igen Kondensation wird der Phosphitdiester mit 0,1 M Jod in THF/Pyridin/Wasser (40:20:1) oxidiert; die Oxidation ist nach 3 bis 5 Minuten beendet, überschüssiges Jod wird durch Waschen mit Pyridin (5-10 ml) bis zum Ausbleiben der Farbe entfernt; danach wird mit THF (20-30 ml) gewaschen. 2 ml eines Gemisches von DMAP/THF/Ac2O/Lutidin (0,6 g, 10 ml, 1,1 g) wird durch die Säule geleitet, wonach man mit 5 ml Pyridin und anschließend mit 30 - 50 ml THF wäscht, um gegebenenfalls zurückgebliebenes Pyridin und Lutidin zu entfernen. Die Kolonne wird im Hochvakuum 10 Minuten lang getrocknet. Eine gesättigte Lösung von ZnBr2 entweder in CH2Cl2/MeOH (7:3) oder Nitromethan/Wasser (100:1) wird durch die Perlen geleitet, bis die Detritylierung beendet ist. Anschließend wird mit nBuOH/Lutidin/THF (4/1:5) (5 ml) gewaschen; schließlich wird nochmals allein mit 30-50 ml THF gewaschen. Anschließend wird die nächste Nucleosideinheit eingeführt, indem man das obige Verfahren mit dem geeigneten Nucleosid-methylphosphomonochloridit wiederholt.Die Zeit für einen vollständigen Reaktionscyclus beträgt 45 - 60 Minuten, im Gegensatz von 4 - 6 Stunden bei Verwendung eines Phosphonomonoesters und MSNT des Kondensationsmittels.
    [0041] Die Nucleosid-methylphosphonodiesterkette wird dann von dem Träger mit Ammoniak (25 %, 2 ml) bei 35°C und einer Reaktionszeit von 15 Stunden entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt; die Perlen werden mit bidestilliertem Wasser (2,3 ml) gespült. Die vereinigten Flüssigkeiten werden unter verringertem Druck eingeengt und an Silicagel-Platten (Acetonitril/Wasser: 80:20) dünnschichtchromatographisch zur Entfernung von nichtnucleotidischem Material entfernt. Die Nucleotidbande auf der Platte wird mit CHCl3/MeOH (7:3) eluiert. Das Produkt wird konzentriert und mit bidestilliertem Wasser lyophilisiert.
    [0042] In gleicher Weise können sowohl Purin als auch Pyrimidin-deoxynucleosid-methylphosphonomonochloridite für die Kondensation mit CPG-gebundenen Purin- und Pyrimidin-deoxynucleosiden eingesetzt werden. Auf diese Weise wurden d(AC) , d(AT), d(ATG) und d(ATTT)- methylphosphonodiester hergestellt. Die Gesamtausbeuten, UV- Absorptionsmaxima und Rf-Werte ergeben sich aus der Tabelle.
    [0043]
    c) Es wurden 2 Diastereomere beobachtet, die sich jedoch nicht als getrennte Flecken auftrennten; d) Gemessen in 10 mM Tris·HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA.
    权利要求:
    Claims

    Patentanspruch
    Verfahren zur Herstellung von Oligonucleosidphosphonaten der allgemeinen Formel I
    in der B eine Nucleobase,
    R1 eine gegebenenfalls verzweigte Alkylgruppe mit 1 - 10 C-Atomen, die mit bis zu 4 Chloratomen oder einer Cyangruppe substituiert sein kann, oder eine gegebenenfalls mit niedrigem Alkyl, niedrigem Alkoxy, Cyan, Halogen oder Nitro substituierte Aryl- oder Aralkylgruppe mit 1 - 2 C-Atomen im Alkylteil, R2 Wasserstoff, Hydroxyl oder gegebenenfalls mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschütztes Hydroxyl und n eine ganze Zahl von 2 - 50 bedeuten, gekennzeichnet durch die folgenden Reaktionsschritte:
    a) Umsetzung eines Nucleosids der allgemeinen Formel II
    in der
    A eine in der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppe, B' die gegebenenfalls mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschützte Nucleobase B und R1 wie oben definiert ist, mit einem Halogenphosphin der allgemeinen Formel III
    in der
    X Chlor oder Brom, Chlor oder Brom, - oder ein reaktiver heterocyclischer Rest und R1 wie oben definiert ist, in Gegenwart einer organischen Base,
    b) Umsetzung des in Schritt a erhaltenen Nucleosid-phosphonomonoderivates der allgemeinen Formel IV
    in der A, B' , R 1 , R2 und Z wie oben definiert sind, mit einem an einen polymeren Träger gebundenen Nucleosid der allgemeinen Formel V
    in der B1 und R2 wie oben definiert und T der polymere Träger ist,
    c) Oxidation des in Stufe b erhaltenen trägergebundenen Nucleotidonucleosids der allgemeinen Formel VI
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1984-05-10| AK| Designated states|Designated state(s): JP US |
    1984-05-10| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): AT BE CH DE FR GB LU NL SE |
    1984-06-26| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1983903507 Country of ref document: EP |
    1984-11-14| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1983903507 Country of ref document: EP |
    1989-01-04| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1983903507 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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